外周血及肿瘤组织中产生il -10的B细胞对胃癌的影响

　　

　　

　　白细胞介素(Interleukin, IL)-10- generated B (B10)细胞响应肿瘤微环境信号产生，并通过与B10细胞相互作用促进肿瘤生长。我们研究了胃癌患者外周血和肿瘤组织样本中免疫细胞的分布。

　　本研究纳入了2020年8月至2021年5月在首尔圣玛丽医院接受根治性胃切除术的胃癌患者。采集外周血42份，胃黏膜2份(正常和癌粘膜;不影响肿瘤的诊断和分期)。采用流式细胞术和免疫荧光法检测外周血和癌黏膜B10细胞。用IL-10培养胃癌细胞系AGS细胞，测定细胞死亡和细胞因子分泌情况。同时，将AGS细胞与CD19 + B细胞共培养，检测细胞因子的分泌。

　　与对照组相比，胃癌患者血液中B10细胞的数量明显增加。在胃粘膜组织的共聚焦图像中，癌粘膜比正常粘膜含有更多的B10细胞。B10细胞在癌黏膜中的数量随癌分期的增加而增加。在细胞死亡条件下培养AGS细胞，IL-10刺激后1天，细胞坏死明显减少，增殖增加。AGS细胞与gc源性CD19+ B细胞共培养后，肿瘤细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-8、IL-1β和血管内皮生长因子显著增加。

　　B细胞可能是通过诱导GC中炎症介质(如IL-10)的产生而促进癌变的细胞群之一。靶向B10细胞活性可以提高抗肿瘤免疫治疗的效果。

　　视频摘要

　　胃癌(Gastric cancer, GC)在世界范围内具有很高的死亡率，通过筛查进行早期诊断可提高生存率[1]。在没有进行内镜筛查的西方社会，当症状出现后被归类为不能手术时，或当GC在治疗后复发时，中位生存期不超过2年[2]。针对程序性细胞死亡-1受体或其配体的免疫检查点抑制剂在其他癌症中的疗效较差[3]。

　　GC患者肿瘤细胞的免疫逃逸机制、细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞等抗肿瘤杀伤细胞功能缺陷、免疫抑制细胞及其抑制细胞因子的存在、肿瘤细胞表面抑制分子的表达，使肿瘤细胞具有高度侵袭性和转移性[4,5]。B细胞，特别是肿瘤浸润性B细胞亚群，可能对胃癌细胞产生直接或间接的影响。B10细胞可能通过阻断促炎淋巴细胞的分化，产生白细胞介素(IL)-10、肿瘤生长因子(TGF)-β等细胞因子对GC细胞具有免疫抑制作用[6,7,8,9]。B10细胞诱导免疫抑制性T细胞分化[10,11]。肿瘤浸润性B细胞亚群是胃癌患者独立的预后良好因素，B10细胞对肿瘤环境的浸润越大，预后越差[7]。

　　B细胞产生IL-10可能与调节性T细胞抑制IL-2、IL-5和肿瘤坏死因子(TNF)-α的产生有关，或与抗原提呈细胞(APCs)相互作用，降低主要组织相容性复合体抗原的表达[8]。因此，产生il -10的B细胞抑制抗肿瘤免疫。事实上，胃癌患者肿瘤组织和外周血中B10细胞的浸润量较高，且随着肿瘤分期的增加而增加[12]。

　　我们评估了胃癌患者外周血和肿瘤组织中B10细胞的数量。

　　本研究纳入了术前经内镜活检证实为腺癌的胃癌患者。根据韩国胃癌治疗指南，这些患者于2020年8月至2021年5月在首尔圣玛丽医院接受了以治愈为目的的常规根治性胃切除术。早期胃癌患者行D1 +淋巴结清扫，局部晚期癌症患者行D2或D2 +淋巴结清扫。采集外周血和胃黏膜组织标本42份，胃黏膜标本(正常和癌粘膜;不影响肿瘤的诊断和分期)。5例患者术后1-3个月采血，与术前比较。将GC患者术前外周血标本与13名健康对照者进行比较。根据第八届美国癌症联合委员会标准对胃癌的病理分期进行分类。本研究已获得韩国天主教大学医学院机构审查委员会批准(KC20TISI0985)。患者记录在分析前被匿名化和去识别。

　　从血液样本中分离出人外周血单核细胞[13]，在GolgiStop (BD Biosciences, San Jose, CA)存在下，用25 ng/mL的肉酸酯phorbol acetate和250 ng/mL的iononomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)刺激细胞4小时。表面染色采用表面异硫氰酸荧光素(FITC)偶联抗cd19、藻红蛋白cy7偶联抗cd24、周绿素叶绿素蛋白偶联抗cd38、和Brilliant Violet?421偶联抗cd138抗体(BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ)。使用Cytofix/Cytoperm溶液(BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ)使表面标记的细胞通透化，并使用异藻蓝蛋白(APC)偶联的抗il -10抗体进行细胞内染色。样品使用FACS Calibur (BD Pharmingen)荧光活化细胞分选仪(FACS)进行分析，数据使用FlowJo软件(Tree Star, Ashland, OR)进行分析。所用抗体列于表1。

　　表1本研究使用的抗体列表

　　GC患者粘膜组织经Sigma脱钙后固定在10%福尔马林中，并包埋于石蜡中。石蜡包埋切片与apc偶联的抗il -10 (Biolegend, San Diego, CA)和fitc偶联的抗cd19 (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ)抗体在4°C下孵育。细胞核用4,6 -二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色;Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加州)。使用200倍放大的LSM 700共聚焦显微镜(蔡司，Oberkochen，德国)获得图像。所用抗体列于表1

　　使用凋亡检测试剂盒(BioVision, Milipitas, CA)检测细胞凋亡和坏死。将AGS细胞接种于24孔培养板中，每孔8 × 104，用抗il -10 (40 ng/mL)抗体刺激24 h。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤2次，用500μL结合缓冲液重悬，用5μL膜联蛋白V-FITC和5μL碘化丙啶(PI)在黑暗中孵育5 min。通过测定膜联蛋白V+/PI+和膜联蛋白V - /PI+细胞的百分比分别计算凋亡率和坏死率。使用FACS Calibur仪器(BD Pharmingen)分析样品，使用FlowJo软件分析数据。

　　使用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)检测细胞增殖;Dojindo Molecular Technologies, MD)。将AGS细胞接种于96孔培养板中，每孔2 × 104，用抗il -10 (20 ng/mL)抗体刺激48 h，每孔加入20 μL CCK-8溶液，37℃，5% CO2孵育1-3 h。450 nm处的吸光度使用微孔板读取器(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)测量。

　　采用夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清中IL-8、IL-1β、TNF-α和血管内皮生长因子(VEGF)水平(DuoSet;R&D Systems，里尔，法国)。用辣根过氧化物酶偶联链亲和素显色。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)微孔板读卡器(Molecular Devices)测定450 nm处吸光度。

　　AGS细胞购自韩国细胞系银行。细胞在含有10%热灭活胎牛血清和抗生素的Roswell Park Memorial Institute-1640培养基中培养，37℃，5% (v/v) CO2。用抗脂多糖(LPS) (100 ng/mL)、-TNF-α (10 ng/mL)或-IL-10(20或40 ng/mL)抗体刺激细胞24或48小时。按照生产商的说明，使用CD19 MicroBeads (130-050-301, Miltenyi Biotec)从GC患者的外周血单个核细胞中分离CD19+ B细胞，并与AGS细胞(10:1比例)共培养72小时。重组人抗il -10和-TNF-α抗体购自R&D Systems (Minneapolis;MN)和LPS来自Sigma-Aldrich。

　　本研究由韩国天主教大学医学院机构审查委员会(KC20TISI0985)根据赫尔辛基宣言和良好临床实践指南批准。所有程序都符合人体实验(机构和国家)负责委员会的道德标准，并符合1964年《赫尔辛基宣言》和后来的版本。从纳入研究的所有患者中获得知情同意或适当的替代品。

　　数据为平均值±平均值的标准误差。采用Prism软件进行统计分析。5;GraphPad软件公司，圣地亚哥，加州)。正态分布的连续数据采用参数Student’s t检验。组均值比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

　　摘要。

　　背景

　　方法

　　结果

　　讨论

　　结论

　　数据和材料的可用性

　　参考文献。

　　致谢。

　　作者信息

　　道德声明

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　　参与者的临床病理特征见表2。胃癌患者的平均年龄为64.61±10.41岁。42例GC患者中，男性30例(71.4%)，平均体重指数为23.77±3.58。健康对照组患者年龄较轻，女性患者较多(P < 0.05, 0.031)。两组患者的吸烟史和合并症也存在差异(表2)。胃癌根治性切除术后，早期胃癌20例(47.6%)，晚期胃癌22例(52.3%)。23例胃癌患者(54.7%)无淋巴结转移。

　　表2胃癌患者与健康对照的临床病理特征

　　FACS分析显示，与对照组相比，GC患者血液中B10细胞(CD19+CD24+CD38+IL-10+)的数量显著增加(分别为14.5和4.85,P < 0.01，图1)。GC患者外周血中浆母细胞(CD19+CD38+CD138+)的数量显著减少(P < 0.01，图2A)，且与B10细胞呈负相关(P < 0.05，图2A)。GC患者的浆细胞(CD19?CD38+CD138+)数量没有明显减少，但没有定量相关性(图2B)。PBMC染色显示胃癌根治术后B10细胞数量减少，浆母细胞和浆细胞数量增加(图3)。

　　图1

　　

　　胃癌患者外周血中B10含量增加。健康对照(HC)和GC患者的PBMCs用PMA和离子霉素刺激4小时，最后用GolgiStop刺激2小时。具有代表性的FACS图显示B10细胞门控(IL-10+ CD19+CD24+CD38 +)。B hcc患者(N=13)和GC患者(N=42) pbmc中B10的平均百分比。平均值±SEM (**P < 0.01)

　　图2

　　

　　胃癌患者的b细胞亚群。A Top为hc (N=6)和GC (N=17)患者外周血中浆母细胞(CD19+CD38+CD138+)的平均百分比。下图为B10细胞与浆母细胞的相关性。上图为hc (N=6)和GC (N=17)患者外周血中血浆B细胞(CD19?CD38+CD138 +)的平均百分比。下图为B10细胞与浆B细胞的相关性。平均值±SEM (**P < 0.01)

　　图3

　　

　　胃癌患者术后免疫抑制改善。在手术前(N=5)和手术后(N=5)用PMA和离子霉素刺激胃癌患者的pbmc 4小时，最后2小时用GolgiStop。显示(A) B10细胞、(B)浆母细胞和(C)浆B细胞的平均百分比。平均值±SEM (**P < 0.01)

　　共聚焦成像显示癌组织中B10的含量高于正常粘膜(分别为5.75和0.67,P < 0.001，图4A和B)。癌组织中B10的含量随着肿瘤分期的增加而增加(I期< II期< III期，P < 0.05, P < 0.01，图4C)。

　　图4

　　

　　GC粘膜B10细胞增多。采用PE-IL-10、FITC-CD19、DAPI对胃癌患者正常及癌性粘膜进行染色。正常(N=12)和癌(N=12)粘膜中B10细胞(CD19+IL-10 +)的代表性共聚焦图像。标尺20 μm。B正常和癌变粘膜中每个高倍视野(HPF)中B10细胞的平均数量。C不同分期癌组织中每HPF B10细胞的平均数量。平均值±SEM (**P < 0.01)

　　我们在LPS和TNF-α存在下培养含IL-10的AGS细胞。IL-10刺激后1天GC细胞凋亡和坏死减少，坏死细胞数量在TNF-α刺激和非刺激条件下差异显著(P < 0.05，图5A)。在相同条件下，IL-10显著增加AGS细胞的增殖(P < 0.05, P < 0.001，图5B)。在存在或不存在LPS的AGS细胞中，IL-10处理2天后，IL-8分泌显著增加(P < 0.001，图5C)。有趣的是，与AGS细胞共培养后，gc来源的CD19+ B细胞分泌的TNF-α、VEGF、IL-8和IL-1β显著增加(P < 0.001，图6)。

　　图5

　　

　　IL-10对肿瘤细胞的影响。将无IL-10 (10 ng/mL)、LPS (100 ng/mL)或TNF-α (10 ng/mL)分别培养24 h (Annexin V和PI染色)和48 h (CCK-8和IL-8酶联免疫吸附试验)。A第1天，用Annexin V和PI染色细胞。代表性的FACS图显示了凋亡和坏死细胞的群体。柱状图显示凋亡细胞(左)和坏死细胞(右)的平均百分比。B CCK-8法测定OD平均值。C.培养上清平均IL-8水平。平均值±SEM (*P < 0.05， ***P < 0.005)

　　图6

　　

　　胃癌患者B细胞对细胞因子产生的影响。将AGS细胞与GC患者的B细胞共培养24小时，显示(A) TNF-α(上、左)、B VEGF(上、右)、c IL-8(下、左)和(D) IL-1β(下、右)的水平。平均值±SEM (***P < 0.005)

　　胃癌在世界范围内的死亡率很高。除东亚地区进行内镜筛查外，> 50%的胃癌患者尽管接受了治疗，但仍出现复发[14,15]。胃癌复发后的平均生存时间≤20个月[15]。除了细胞毒性抗癌药物外，替代治疗方案的益处证据尚不明确。虽然转向手术有望使对抗癌药物有反应的患者受益，但缺乏证据[16]。靶向药物和免疫检查点抑制剂适用于一小部分患者，但收效甚微[17,18,19]。因此，需要新的方法来改善4期或复发性胃癌患者的预后。

　　癌症治疗旨在恢复、维持和/或增强免疫系统，以促进癌细胞的检测和清除。以前，治疗的重点是激活先天免疫细胞，如自然杀伤细胞和树突状细胞，但效果不够有效[9,18,19]。人们已经努力增强T细胞和B细胞靶向肿瘤细胞的作用，针对程序性细胞死亡蛋白1 (PD1)、程序性死亡配体1 (PD-L1)或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4的免疫检查点抑制剂可能对胃癌患者有效，以达到缓解目的[18]。另一种选择是使用嵌合抗原受体T细胞来最大化抗肿瘤效果，但在临床应用之前需要进一步的工作。

　　在本研究中，与对照组相比，GC患者外周血中的B10细胞群明显增加(图1)。IL-10通过信号转导和转录激活因子(STAT) 3介导的信号转导诱导免疫抑制，其中涉及酪氨酸激酶磷酸化和STAT转录因子的激活[11]。IL-10可以阻止树突状细胞的成熟，抑制CD4+ T细胞的增殖和细胞因子的产生[20]。

　　在前列腺癌或乳腺癌中，IL-10+CD19+细胞通过产生IL-10抑制肿瘤微环境中的效应免疫细胞，并通过诱导调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)和释放抗炎介质促进肿瘤转移[21]。IL-10+CD19+CD24+CD38+PD-L1+ B10细胞与Treg增殖和分化相关，抑制PD-1hi效应T细胞的抗肿瘤反应。此外，B10细胞控制参与B细胞向质母细胞转变的基因的表达，导致乳腺癌的侵袭和进展[22,23]。

　　在胃癌患者中，肿瘤相关巨噬细胞分泌的IL-10通过c-间充质上皮转化蛋白/STAT3信号调节胃癌细胞的增殖和侵袭[24]。在胃癌中，肿瘤内产生il -10的巨噬细胞的富集与不良的临床结果有关[25]。此外，产生il -10的B细胞通过与T细胞相互作用发挥抗肿瘤作用。据报道，产生il -10的B细胞在瘤内环境中富集，并显著改变GC中CD4和CD8 T细胞产生的细胞因子[8]。B10细胞和质母细胞通过IL-10信号传导抑制T细胞介导的致病性炎症以及抗病毒T细胞反应[26]。B10细胞产生TGF-β诱导Foxp3表达，从而促进Tregs的分化[11]。

　　在本研究中，胃癌根治术后患者外周血中产生il -10的B细胞比例下降(图3A)，癌性粘膜中产生il -10的B细胞比例高于正常粘膜(图4A)。B10细胞阻止有效的抗肿瘤免疫反应。在存在和不存在细胞死亡条件的情况下，IL-10培养后1天GC细胞凋亡和坏死减少(图5A)。然而，IL-10处理可增加GC细胞的增殖(图5B)。这些数据显示了IL-10在抗肿瘤反应中的直接预防作用。GC细胞与患者源性B细胞共培养可显著增加炎性细胞因子TNF-α、VEGF、IL-8和IL-1β的分泌。IL-8的表达与胃癌的不良预后相关，因为它具有趋化、中性粒细胞活化和促血管生成的作用。我们的体外数据，与IL-10或与B细胞共培养，表明B10细胞可能通过增加这些促炎细胞因子的产生来促进GC细胞增殖[27]。在本研究中，由于疾病的特异性，GC患者和健康对照者的特征没有很好地匹配，这是一个局限性。因此，由于年龄、性别和合并症，免疫状态可能存在差异。然而，我们的体外研究结果表明，调节B10可以增强抗肿瘤作用，但临床应用需要进一步的研究和开发。它很难直接靶向肿瘤细胞，增强全身免疫也不能起到抗癌作用。靶向B10可以改善胃癌的预后，作为一种辅助治疗，增加全身和特异性抗癌免疫，最大限度地发挥手术、化疗、单克隆抗体和免疫检查点抑制剂的作用。

　　综上所述，B10细胞可能通过诱导胃癌局部产生炎症介质，如IL-10，直接促进癌变。我们的研究结果表明，靶向B10细胞可以改善抗肿瘤免疫治疗的效果。

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